Ocena działania przeciwdrobnoustrojowego wybranych europejskich gatunków grzybów...
Projekt pt. "Ocena działania przeciwdrobnoustrojowego wybranych europejskich gatunków grzybów z rodzaju Phellinus s.l. ich potencjalnego zastosowania w leczeniu zakażeń spowodowanych szczepami bakterii o oporności wielolekowej" uzyskał dofinansowanie w konkursie na granty pt. „ISKRA - budowanie międzyuczelnianych zespołów badawczych” realizowanym w ramach Politechnicznej Sieci VIA CARPATIA im. Prezydenta RP Lecha Kaczyńskiego. Kierownikiem projektu jest dr Ewa Ciszkowicz z Katedry Biotechnologii i Bioinformatyki na Wydziale Chemicznym Politechniki Rzeszowskiej. Projekt realizowany jest przez zespół badawczy z Politechniki Białostockiej, Politechniki Lubelskiej i Politechniki Rzeszowskiej. Liderem projektu jest Politechnika Białostocka.
Zespół badawczy
Politechnika Białostocka: wykonawca wiodący dr Ewa Zapora, wykonawcy:dr hab. Monika Kalinowska, prof. PB, prof. dr hab. Włodzimierz Lewandowski, dr hab. Renata Świsłocka, prof. PB, dr hab. Elżbieta Wołejko, prof. PB, dr hab. Agata Jabłońska-Trypuć, prof. PB, dr inż. Urszula Wydro, dr Marcin Stocki, mgr inż. Ewelina Gołębiewska, Marek Wołkowycki
Politechnika Lubelska: wykonawca wiodący prof. dr hab. Małgorzata Pawłowska, wykonawcy dr hab. inż. Grzegorz Łagód, prof. PL, dr hab. inż. Jacek Czerwiński, prof. PL, dr inż. Magdalena Zdeb, dr inż. Marta Bis, dr Justyna Kujawska
Politechnika Rzeszowska: wykonawca wiodący dr Ewa Ciszkowicz, wykonawcy dr hab. Aleksandra Bocian, prof. PRz, mgr inż. Marcin Jaromin
Opis projektu
Antybiotykooporność jest coraz częstszym i znaczącym zagrożeniem dla ludzi, a wymiar tego zjawiska spowodował, że to jedno z kluczowych niebezpieczeństw dla zdrowia publicznego na całym świecie. Kiedy w latach 40. i 50. XX w. antybiotyki określano tzw. „miracle drugs” nikt nie przypuszczał, że w ciągu zaledwie jednego pokolenia bakterie uodpornią się na antybiotyki i sytuacja zmieni się diametralnie. W wyniku oporności na antybiotyki tylko w Europie umiera ok. 700 tys. ludzi rocznie. Prognozy wskazują, że liczba ta w 2050 r. osiągnie 10 mln ludzi rocznie. Nowych, skutecznych antybiotyków praktycznie nie ma, przez co wzrasta śmiertelność z powodu zakażeń wywoływanych przez oporne bakterie.
Obserwowany w ostatnich latach ogromny wzrost zainteresowania grzybami jako rezerwuarami naturalnych związków aktywnych wynika z szerokiego zakresu ich działania biologicznego. Grzyby przez stulecia były uznawane nie tylko za element diety człowieka, lecz także są wykorzystywane od ok. 7 tys. lat w tradycyjnej medycynie chińskiej. Wśród grzybów wielkoowocnikowych istnieje m.in. liczna grupa o udowodnionych, silnych właściwościach farmakologicznych. Są to tzw. grzyby medyczne (ang. Medicinal Mushroom). Badania potwierdzają ich działanie: antynowotworowe, immunomodulacyjne, przeciwzapalne, antyutleniające, antywirusowe, antybakteryjne, antygrzybicze, przeciwpasożytnicze, antyhipercholesterolemiczne, detoksykacyjne, hepatoprotekcyjne i przeciwcukrzycowe.
O możliwości zastosowania grzybów do otrzymywania preparatów leczniczych decydują ich dwie ważne cechy: zdolność do biosyntezy metabolitów wtórnych o silnym działaniu biologicznym oraz posiadanie niezwykle rozbudowanego aparatu enzymatycznego, umożliwiającego przeprowadzanie złożonych reakcji biotransformacji. Grzyby wspomagają układ odpornościowy, a także są z powodzeniem stosowane w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych czy cywilizacyjnych (choroba Alzheimera, cukrzyca). Obecnie ekstrakty z grzybów lub wyizolowane z nich frakcje związków bioaktywnych wykorzystywane są do produkcji leków, suplementów diety, dodatków do żywności, żywności specjalnego przeznaczenia medycznego.
Doniesienia naukowe potwierdzają wysoką, udokumentowaną aktywność antybakteryjną grzybów medycznych, m.in przeciw Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae czy Escherichia coli. Rodzaj Phellinus s.l. należy do rodziny Hymenochaetaceae i obejmuje ponad 220 opisanych taksonów na całym świecie, z czego w Europie 35 taksonów. Niektóre gatunki należące do tego rodzaju były tradycyjnie wykorzystywane w medycynie chińskiej i mają udowodnione działanie prozdrowotne. Niemniej jednak Phellinus s.l. jest to trudny taksonomicznie rodzaj i mimo że jest bogaty w gatunki to zaledwie niewielka ich część jest przebadana. Większość dostępnych badań aktywności dotyczy zaledwie kilku gatunków, m.in. Phellinus igniarius, P. linteus, P. gilvus, P. pini czy P. hartigii. W przypadku zdecydowanej większości taksonów europejskich i światowych brak jest w literaturze danych o ich aktywności.
W ramach tego projektu na Politechnice Białostockiej zostaną przeprowadzone badania ekstraktów z wybranych, dotąd niebadanych pod kątem posiadanych właściwości biologicznych, gatunków europejskich grzybów z rodzaju Phellinus s.l w celu oceny ich działania przeciwdrobnoustrojowego. W ramach realizacji projektu wszystkie wytworzone na potrzeby badań ekstrakty Phellinus s.l. zostaną włączone do Fungi Extract Bank® (FEB), kolekcji zawierającej obecnie ponad 250 ekstraktów z grzybów nadrzewnych, zgromadzonej w Instytucie Nauk Leśnych Politechniki Białostockiej, nierzadko z unikatowych i rzadkich gatunków.
Przedmiotem badań będzie zbiór wybranych europejskich taksonów grzybów z rodzaju Phellinus s.l. z terenu Polski oraz Macedonii Północnej (zbiór niewystępujących w Polsce taksonów charakterystycznych dla strefy śródziemnomorskiej). Innowacja w projekcie związana jest z objęciem badań większości gatunków europejskich, które nie były do tej pory pod tym kątem badane. Brak badań w tym kierunku związany jest z wyjątkowo trudnym procesem identyfikacji taksonomicznej, który jest w stanie prawidłowo wykonać niewielu specjalistów – mykologów na świecie, w tym pracownik Instytutu Nauk Leśnych (INL PB). Z zebranych owocników zostaną wykonane ekstrakty metodą klasycznej ekstrakcji rozpuszczalnikowej, które będą stanowić podstawę badań antyoksydacyjnych i przeciwdrobnoustrojowych.
W celu potwierdzenia pozycji taksonomicznej badanych gatunków grzybów oraz uzyskania kompleksowej informacji o sekwencji genów związanych z wytwarzaniem i/lub degradacją docelowych substancji aktywnych na Politechnice Rzeszowskiej zostanie przeprowadzona wszechstronna i kompleksowa charakterystyka genetyczna z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania następnej generacji (ang. Next Generation Sequencing, NGS). Planowane analizy obejmują sekwencjonowanie całogenomowe z 30–50-krotnym pokryciem w celu uzyskania sekwencji niezbędnych do identyfikacji tożsamości gatunkowej oraz poznania genów istotnych z punktu widzenia biodegradacji i biosyntezy związków biologicznie czynnych. Otrzymane wyniki mogą stanowić podstawę do dalszych badań zmierzających do zastosowań komercyjnych i planowania procesów biotechnologicznych.
Badania przeciwdrobnoustrojowe i antyoksydacyjne ekstraktów z wybranych gatunków grzybów z rodzaju Phellinus s.l. będą przeprowadzone na Politechnice Białostockiej w celu wyselekcjonowania gatunków grzybów o najwyższym potencjale przeciwdrobnoustrojowym i antyoksydacyjnym z rodzaju Phellinus s.l. oraz określenia metodami spektroskopowymi frakcji związków chemicznych występujących w wysuszonych owocnikach grzybów i ich ekstraktach. Przeprowadzone zostaną badania przeciwdrobnoustrojowe na wybranych certyfikowanych szczepach bakteryjnych (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Kocuria rhizophila i Lactobacillus rhamnosus) i grzybowych (Candida albicans). Zostanie określona wartość minimalnego stężenia hamującego wzrost bakterii (ang. Minimum Inhibitory Concentration, MIC) oraz strefy zahamowania wzrostu drobnoustrojów dla wybranych stężeń ekstraktów przez zastosowanie metody krążkowo-dyfuzyjnej Kirby–Bauera w celu porównania ich działania z antybiotykami. W przypadku ekstraktów o najwyższej aktywności antymikrobiologicznej planowane są także badania cytotoksyczności in vitro oraz ocena aktywności antyoksydacyjnej ekstraktów, w wyniku których zostaną zidentyfikowane gatunki Phellinus s.l. posiadające najwyższy potencjał przeciwrodnikowy. W tym celu zostaną wykonane spektrofotometryczne testy aktywności antyoksydacyjnej, w tym test z rodnikiem DPPH, z kationorodnikiem ABTS oraz test peroksydacji lipidów.
Znajomość składu chemicznego substancji aktywnych obecnych w ekstraktach ma olbrzymie znaczenie w ocenie działania terapeutycznego potencjalnych preparatów. Umożliwi też ocenę, które substancje chemiczne odpowiadają za aktywność biologiczną. Dlatego też zostaną przeprowadzone: identyfikacja jakościowa i ilościowa substancji aktywnych w wybranych ekstraktach, oznaczenie zawartości makro- i mikroelementów, określenie składu pierwiastkowego (C, N, H, S) oraz badania termicznego rozkładu ekstraktów. Zawartość substancji aktywnych w badanych ekstraktach zostanie oznaczona metodą chromatografii gazowej (ang. Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS). Oznaczenia makro- i mikroelementów będą wykonane za pomocą absorpcyjnej spektroskopii atomowej, natomiast zawartość pierwiastków (C, N, H, S) będzie oznaczona za pomocą analizy elementarnej. Stosując analizę termograwimetryczną (TG, DTG, DSC), zostanie określona zawartość wody oraz podatność próbek na rozkład pod wpływem podwyższonej temperatury.
Pomimo obszernej wiedzy dotyczącej grzybów medycznych substancje aktywne wchodzące w ich skład oraz mechanizmy odpowiedzialne za ich efekty przeciwdrobnoustrojowe, zwłaszcza wobec szczepów bakterii chorobotwórczych wykazujących oporność wielolekową, nie są do końca poznane. Na Politechnice Rzeszowskiej zostanie więc przeprowadzona ocena aktywności antybakteryjnej wybranych ekstraktów wobec klinicznych szczepów bakterii chorobotwórczych o zdefiniowanej lekooporności przez określenie wartości MIC oraz minimalnego stężenia bakteriobójczego (ang. Minimum Bactericidal Concentration, MBC). Przetestowane będą ekstrakty o najwyższym potencjale antybakteryjnym i antyoksydacyjnym, wyselekcjonowane we wcześniejszych etapach wobec klinicznych szczepów bakterii chorobotwórczych (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis).
Na etapie oceny możliwości wykorzystania wybranych ekstraktów jako źródła substancji o działaniu antybakteryjnym konieczne jest wykluczenie ich cytotoksyczności wobec prawidłowych komórek ludzkich w systemie in vitro. W tym celu zostaną wykonane analizy żywotności ludzkich linii prawidłowych fibroblastów (BJ, HsSK) oraz keratynocytów (HaCaT) w odpowiedzi na traktowanie ich wybranymi ekstraktami. Zbadana również zostanie zdolność do zmniejszania indukowanego H2O2 stresu oksydacyjnego w komórkach ludzkich przez obniżenie poziomu dialdehydu malonowego (MDA), poprawę aktywności enzymów antyoksydacyjnych, tj. dysmutazy ponadtlenkowej, katalazy, peroksydazy glutationowej.
Rozważając możliwość wykorzystania ekstraktów z grzybów w skali przemysłowej, należy wziąć pod uwagę również sposób zagospodarowania pozostałości po procesie ekstrakcji. Ze względu na jej organiczny charakter możliwą drogą zagospodarowania jest jej użycie np. do produkcji biogazu. Jednak ze względu na złożony skład chemiczny biomasy pochodzącej z ekstrakcji wybranych gatunków grzybów oraz obecność w biomasie pozostałości różnych rodzajów ekstrahentów istnieje ryzyko wystąpienia inhibicji fermentacji. Nie znany jest również potencjał biogazowy takich materiałów. Problem środowiskowy może również stanowić niekontrolowane przedostanie się pozostałości poekstrakcyjnej lub substancji bioaktywnych zawartych w ekstraktach do środowiska, gdzie mogą wpływać na procesy biochemiczne, które w nim zachodzą. Potencjalne zastosowanie grzybów, np. do produkcji leków czy preparatów enzymatycznych służących do obróbki wstępnej biomasy, wiąże się z takim ryzykiem, w szczególności z ich obecnością w ściekach i biomasie poddanej fermentacji metanowej. Aby móc przewidywać konsekwencje dostania się ekstraktów do środowiska, potrzebna jest m.in. ocena ich podatności na biodegradację, zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych, jak również ocena ich wpływu na organizmy, w tym mikroorganizmy zasiedlające bioreaktory z osadem czynnym i komory fermentacyjne w oczyszczalniach ścieków. Ten obszar badań będzie realizowany na Politechnice Lubelskiej.
Grzyby to wyjątkowe organizmy, nie tylko z perspektywy ich znaczenia w funkcjonowaniu środowiska leśnego, lecz również w związku z ich aktywnością, która może mieć fundamentalne znaczenie dla zdrowia ludzi i zwierząt. Znajdują się na szczycie zainteresowań badaczy ze względu na to, że stanowią rezerwuary ogromnej liczby naturalnych związków aktywnych o szerokim zakresie działania. Szczególnie cenne są tzw. grzyby medyczne, stanowiące grupę o udowodnionych, również w badaniach klinicznych, silnych właściwościach farmakologicznych.
Planowane w trakcie realizacji projektu badania mają zarówno wymiar naukowy, jak i praktyczny. Po pierwsze planowane terenowe badania mykologiczne są zawsze realizowane w taki sposób, że dokonywany jest zbiór zarówno docelowych owocników (w tym przypadku z rodzaju Phellinus s.l.), jak i zbiór większej liczby taksonów grzybów. Rezultatem tak obszernie prowadzonych badań taksonomicznych i genetycznych może być odkrycie nowych dla Polski, Europy, a nawet nauki gatunków grzybów. Ponadto pogłębione badania taksonomiczne i genetyczne rzadkich taksonów grzybów z rodzaju Phellinus s.l. dostarczą nowej i aktualnej wiedzy o rozmieszczeniu i zasobach tych gatunków w lasach Polski i Macedonii Północnej. Kolejnym bardzo istotnym naukowym wymiarem projektu jest nowa wiedza w zakresie aktywności biologicznej zebranych gatunków, które do tej pory w skali europejskiej i w kontekście ich działania przeciwdrobnoustrojowego nie były w ogóle badane. Oczekiwane wyniki realizacji badań mają również wymiar praktyczny i aplikacyjny. Podejmowane badania to przykład nauki na rzecz społeczeństwa. Mogą mieć one wymiar globalny, a bezpośrednimi beneficjentami efektów będą ludzie i zwierzęta (zarówno w kontekście leczenia, jak i profilaktyki). Naukowcy, leśnicy, pracownicy instytucji ochrony przyrody to z kolei beneficjenci praktycznych wyników badań bioróżnorodności mykobioty grzybów z rodzaju Phellinus s.l. z terenu Polski i Europy.
Więcej informacji na temat projektu można znaleźć w w publikacji „ISKRA – budowanie międzyuczelnianych zespołów badawczych”.
